近日，化学化工学院分子材料化学与技术研究所、江西省功能分子材料化学重点实验室张家林课题组的研究论文“CRISPR/Cas9-mediated 16S rDNA electrochemical sensor for ultrasensitive detection ofEscherichia coliby functionalized COFs and hyperbranched-RCA reaction”在分析化学领域顶级期刊《Sensors and Actuators B: Chemical》（SCI一区Top期刊，影响因子8.4）公开发表，学生第一作者为2022级硕士研究生周鸣，通讯作者为张家林博士和中南林业科技大学任佳丽教授。

细菌感染对人类健康构成严重威胁，因为食用细菌可导致严重疾病甚至死亡，每年在全球造成数十亿人患病或死亡。大肠杆菌（E. coli）可导致灾难性症状，如出血性腹泻、尿路感染（UTI）、肾衰竭，甚至内毒素中毒。因此，开发一种快速、低成本、准确的细菌检测方法迫在眉睫。电化学技术因其响应速度快、成本低和操作简单等独特优势，在分析检测领域得到极大关注。为了提高检测的灵敏度，共价有机框架（COFs）和滚环扩增反应（RCA）反应被用于进一步放大信号。共价有机框架（COFs）因其独特的物理和化学特性，如精确可调的通道、良好的热稳定性、生物相容性和高比表面积，可作为生物分子检测中信号放大的载体。此外，还可以通过对COFs孔表面和内壁进行功能化处理，实现金属或纳米粒子的负载，从而构建新型检测方法，满足生物医学领域日益增长的分子诊断需求。RCA是一种特殊的等温基因扩增方法，能够在温和的环境下使用热稳定的DNA聚合酶进行扩增。由于其等温、高效和经济的优点，RCA被广泛用于细菌的快速检测。

张家林课题组基于共价有机框架（COFs）和RCA扩增技术实现了大肠杆菌超灵敏检测。策略如图1所示，大量RP/H₂/blocker化合物被修饰在电极表面。当系统中存在大肠杆菌特定的16S rDNA片段时，这些序列可被CRISPR-Cas9系统识别并裂解，从而不断产生大量的触发探针。这些释放出的探针可以与RP/H1/blocker杂交体上的阻断剂杂交，从而暴露出H1的粘性末端，有效结合模板序列。当系统中加入T4 DNA连接酶时，挂锁探针会在连接点处直接连接，形成环化DNA。在Phi 29聚合酶的作用下，HB-RCA扩增得以进行，并产生了大量RCA产物，这些产物可提供重要的带状位置。通过引入GOx-AuNPs-COF-H₂纳米复合材料，H₂探针可以与RCA产物杂交，从而与电极表面结合。加入葡萄糖溶液后，GO_x可在检测系统中催化葡萄糖，从而为细菌检测提供显著的电流信号，因此获得用于细菌检测的显著电流变化。该策略具有高灵敏度（LOD为20 CFU/mL），能够实现细菌的快速检测）。由于具有良好的灵敏度和特异性，该方法在食品安全和疾病诊断方面具有巨大潜力。

图1.通过功能化COF和超支化-RCA反应构建CRISPR/Cas9介导的16S rDNA电化学传感器的示意图。

通过扫描电镜、透射电镜、傅里叶红外光谱和XRD验证了金纳米粒子复合之后并没有改变COFs的框架结构。（图2）

图2.（COF（A、E）和COF-Au（B、F）的SEM和TEM图像。(C) TAPB、DMTP和COF的傅立叶变换红外光谱。(D) COF的XRD图谱。

此外，还通过电化学阻抗、琼脂糖凝胶电泳以及循环伏安法进一步验证了传感策略的可行性（图3）。这些结果表明，只有靶标存在，才能触发RCA反应和葡萄糖氧化酶的催化反应。同时也表明该电化学传感器具有较高的灵敏度。

图3.(A)利用579纳米波长处记录的荧光光谱验证触发探针存在（a）和不存在（b）时链置换反应的可行性。(B)在含有0.1 M KCl的5 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-中逐步制造的电化学生物传感平台的CVs和(C) EIS。(a)裸电极，(b) RP/H1/blocker修饰电极，(c)链置换反应后，(d)空白样品检测，(e) RCA反应后。(D)在氧气饱和的PBS（pH值为7）中进行的电化学特性研究。(a）裸电极，（b）RCA反应后，（c）GOx催化后，（d）空白样品。(E）琼脂糖凝胶电泳测量。第1列：RP/H1/阻断剂；第2列：链置换反应产物；第3列：RCA反应产物；第M列：DNA标记（10²-10⁴bp）。

实验对模拟人血清和牛奶样品中的大肠杆菌进行了回收率检测。将浓度为20～2×10⁸CFU/mL的大肠杆菌加入人血清和牛奶检测样品溶液中。结果表明，模拟的人血清和奶样品检测的细菌回收率为87.5%～115.5%。说明方法满足大肠杆菌的实际检测需要。

据悉，本研究得到了国家自然科学基金项目、江西省自然科学基金、湖南省科技创新平台计划、湖南省重点研发计划、研究生创新专项基金项目和大学生创新专项的资助。

论文信息：CRISPR/Cas9-mediated 16S rDNA electrochemical sensor for ultrasensitive detection ofEscherichia coliby functionalized COFs and hyperbranched-RCA reaction.Sensors and Actuators: B. Chemical, 2024, DOI:10.1016/j.snb.2024.135610

文、图/张家林

审核/刘遂军

编辑/陈琰