本网讯 近日，江西理工大学化学化工学院（功能晶态材料化学江西省重点实验室）张家林课题组的研究论文“Ultrasensitive Electrochemical Biosensor for DNA Methylation Detection Based on Fe-MOF/PANI and Catalytic Hairpin Assembly Cascade Reaction”在分析化学领域顶级期刊《Analytical Chemistry》（SCI一区Top期刊，影响因子6.7）公开发表，第一作者为2023级硕士研究生毛碧瑶，通讯作者为江西理工大学张家林副教授。
DNA甲基化是生物界广泛存在的表观遗传修饰，在基因表达调控、基因组稳定性维护和生物发育中起着重要作用。它通过甲基转移酶的作用将甲基转移到腺嘌呤或胞嘧啶上，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，导致碱基甲基化。异常DNA甲基化与癌症的发生和发展之间存在着深刻的联系。因此，DNA甲基化的有效检测对癌症的早期诊断具有重要意义。
针对现有方法如聚合酶链式反应（PCR）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）存在的操作复杂等局限，电化学生物传感器因其高灵敏度、快速响应和显著的成本效益，为DNA甲基化检测提供了一种替代方法。为了更精确、更灵敏地评估目标，多种纳米材料被开发来构建电化学生物传感器，以放大电化学信号。其中MOFs具有高孔隙率、大表面积、化学稳定性和众多活性位点等特点，将聚苯胺（PANI）掺杂到Fe-MOF中，复合材料表现出增强的稳定性和高导电性，从而放大了检测的电信号。作为抗体和酶的替代品，DNA酶表现出与核酸酶相似的位点特异性和催化活性。催化发夹组装（CHA）反应具有反应时间短、无需酶消化、检测灵敏度高、操作简单等优点。将DNA酶与CHA扩增技术结合有助于提升检测的灵敏度。
基于此，研究团队结合Fe-MOF/PANI复合材料和CHA反应，构建了一种新型电化学生物传感器，用于DNA甲基化的超灵敏检测。Fe-MOF/PANI/S1作为信号探针，与单个组分相比，其稳定性和氧化还原活性增强。DNA酶用于催化和切割DNA分析物。在辅助探针的存在下，完整的甲基化DNA被释放以触发CHA反应，产生大量的十字形DNA复合物。这些十字形DNA复合物可以连接到电极表面并与捕获探针杂交，这暴露了十字形CHA产物的结合位点，从而有效地与大量的Fe-MOF/PANI/S1信号探针结合。因此，产生了显著的电化学信号，实现甲基化DNA的检测，检出限低至0.58 fM。所构建的传感器显示出高灵敏度和稳定性，在甲基化相关疾病的风险评估中具有巨大的潜在应用。构建策略如图 1 所示。
图 1.基于Fe-MOF/PANI和CHA级联反应用于检测甲基化DNA的电化学生物传感器的构建示意图；（A）Fe/MOF/PANI/S1的制备；（B）传感器的组装过程。
通过傅里叶变换红外光谱、X 射线光电子能谱（XPS）以及X射线衍射（XRD）对Fe-MOF、PANI和Fe-MOF/PANI进行表征，验证材料被成功制备（图 2）。为了评估Fe-MOF/PANI的功能，检测了Fe-MOF/AuE、PANI/AuE和Fe-MOF/PANI/AuE的DPV电流值。与Fe-MOF修饰电极和PANI修饰电极相比，Fe-MOF/PANI修饰电极显示出较高的峰值电流。尽管Fe-MOF具有较大的比表面积，但其导电性相对较差。与Fe-MOF和PANI修饰电极相比，Fe-MOF/PANI/S1修饰电极结合了Fe-MOF的高比表面积和PANI的导电性，其协同作用促进了快速电子转移，从而显著增强了电流响应。
图 2. （A、B）Fe-MOF和Fe-MOF/PANI的SEM图像；（C）Fe-MOF的TEM图像；（D）Fe-MOF/PANI中C、N、O和Fe的元素映射；（E）Fe-MOF、PANI和Fe-MOF/PANI的FT-IR光谱；（F）Fe-MOF、PANI和Fe-MOF/PANI的XRD图；（G）Fe-MOF/PANI的XPS光谱。
通过循环伏安法（CV）、电化学阻抗谱（EIS）验证了该传感策略在电极上组装过程的可行性（图 3A-B）。通过琼脂糖凝胶电泳对CHA传感过程进行了评估（图 3C）。图3D显示了在靶DNA存在下生物传感器在PBS溶液中的DPV曲线。当存在甲基化DNA时，电流响应显著增强，表明DNA十字形链是由甲基化DNA驱动的CHA反应产生的。当DNA十字形链与电极表面的S2探针杂交时，它可以有效地与Fe-MOF/PANI/S1信号探针连接以产生电信号。相比之下，在没有甲基化DNA的情况下，生物传感器表现出较低的电流变化。这些结果证实了检测甲基化DNA的可行性。
图3.在含有0.1 M KCl的2 mM Fe（CN）6]3-/4-中逐步制备的电化学生物传感平台的CV（A）和EIS（B）图谱：（a）裸AuE，（b）AuE/S2，（c）DNA交叉形DNA/AuE/S2，以及（d）Fe MOF/PANI/S1/十字形DNA/AuE/S2；（C）琼脂糖凝胶电泳测定；（D）在10 mL PBS缓冲液（0.05 M，pH=6.5）中，有和没有DNA甲基化的传感器的DPV反应。
为了评估生物传感器的性能，在最佳条件下研究了甲基化DNA浓度对电流的影响。如图4A所示，在1 fM至100 nM的范围内，DPV峰值电流随着甲基化DNA浓度的增加而增加。甲基化DNA浓度超过100nM后，信号随着浓度的增加而缓慢增加。如图4B所示，DPV峰电流与甲基化DNA浓度的对数呈线性关系。线性回归方程为I=-0.79lgC-1.72（R2=0.99）。使用3σ标准，甲基化DNA检测的检出限为0.58 fM。
图4.（A）在1fM至108fM的浓度下的DNA甲基化检测的DPV曲线；（B）在1fM至108 fM范围内DNA甲基化浓度对数与电流的线性关系图。
为了验证传感平台的实用性，采用构建的生物传感器分析掺有甲基化DNA的人血清样本。将浓度范围为1 fM至500 fM的甲基化DNA添加到10%正常人血清中。结果显示，计算的回收率从93.4%变化到103.5%，RSD范围为1.54%到3.27%，表明该传感器适用于复杂的实际样品检测。
本研究开发了一种基于Fe-MOF/PANI复合材料和CHA级联反应的新型电化学生物传感器，用于超灵敏检测甲基化DNA。通过将PANI掺杂到Fe-MOF框架中，开发了一种有效的信号放大载体。DNA酶可以催化和切割DNA分析物。在辅助探针的存在下，完整的甲基化DNA被释放以触发CHA反应，产生大量的十字形DNA复合物。Fe-MOF/PANI/S1与电极表面连接的十字形DNA复合物结合，产生灵敏的电化学信号，实现甲基化DNA检测。该传感器在1 fM–100 nM范围内表现出优异的线性响应，检出限低至0.58 fM，并显示出优异的特异性、可重复性（RSD=2.23%）和稳定性（20天后信号保留率超过90%）。此外，其在人血清中的高回收率验证了实际应用的可行性。该方法具有灵敏度高、操作简单、成本效益高等优点，为DNA甲基化的灵敏检测提供了一种替代方法。
据悉，本工作得到了国家自然科学基金、江西省自然科学基金和功能晶态材料化学江西省重点实验室等资助。
张家林副教授研究方向为功能材料制备以及生命科学中分析方法的构建等，主持国家自然科学基金、江西省自然科学基金等项目7项。先后在Anal. Chem、 Biosens. Bioelectron、Sensors and Actuators: B、ACS Sensors等重要国际期刊发表SCI论文40余篇，累计影响因子大于300，总他引次数达500余次。近年来，以第一作者或通讯作者身份在ESI高倍引论文1篇，SCI一区TOP(中科院分区) 学术论文14篇，SCI二区(中科院分区) 学术论文2篇。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c06027
文、图/张家林
一审/黄海平
二审/陈琰
三审/夏李斌、刘遂军
